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动物细胞工程试题 动物细胞工程题目及答案篇一
【教学目标】 1．知识目标：
1.1简述动物细胞的培养过程、条件及其应用； 1.2简述克隆动物的概念含义和基本原理
1.3简述体细胞核移植技术和动物克隆技术，以及应用前景 1.4简述细胞融合的方法过程和单克隆抗体的制备过程应用 1.5关注克隆技术的伦理问题。2．能力目标：
2.1通过阅读、自学、质疑、讨论、总结等环节，提高获取知识、分析问题和解决问题的能力
2.2由植物体细胞杂交技术导出动物细胞融合过程，培养学生的知识迁移能力和思维能力
2.3通过设计单克隆抗体的制备过程，使学生了解生物科学认识模式发展学生的创造性能力。3．情感态度与价值目标：
3.1 初步培养学生探索、创新和合作精神
3.2 明确知识不断更新并向前发展，认识到学无止境，形成终生学习的意识。
【教学重点】简述动物细胞的培养过程；举例说出细胞融合和单克隆抗体；关注克隆技术的伦理问题。
【教学难点】动物细胞培养过程；细胞融合技术和单克隆抗体的制备。【教学设计思路】 采用自学、指导模式对动物细胞培养技术进行较深刻、透彻地学习，这部分内容主要是解决三个问题：（1）为什么要进行动物细胞的培养？（2）什么是动物细胞的培养？（3）怎样进行动物细胞的培养？第三个问题是本节课的重点。关于动物细胞的培养过程，教师可参照教材中的动物细胞培养过程示意图进行讲解，讲解中要注意区分原代培养和传代培养这两个概念。对于动物细胞培养的条件，则要从学生已有的内环境的知识出发，启发学生自己动脑思考这个问题，以加深对培养条件的理解。为学习其他动物细胞工程打好基础。在动物体细胞核移植技术及克隆动物的教学中，可首先让学生列举所知道的克隆动物，调动学生已有的知识。随后可向学生提问：克隆动物的方法与植物组织培养一样吗？然后向学生说明目前动物体细胞克隆是通过核移植技术来实现的，以引入本节的主题。关于核移植技术发展简史，可让学生在课堂上阅读，本节的重点和难点是在动物体细胞核移植技术过程，教材中选用了 “多利羊”为例，来说明体细胞核移植的过程。教师应充分利用和挖掘教材内容，带领学生一步步弄清动物体细胞核移植技术的过程。对于体细胞核移植技术的应用前景和存在的问题这部分内容，可结合本节教材“积极思维”中的有关问题，让学生讨论。在细胞融合和单克隆抗体的教学中，教师启发学生回忆植物体细胞杂交过程；通过新旧知识对比，引导学生大胆推测动物细胞融合过程，培养学生知识迁移能力，并通过课件演示细胞融合的全过程，加强教学的直观性，培养学生的观察、思维能力。教师要讲明动物细胞融合技术的意义和应用，以便自然过渡到单克隆抗体上来。关于单克隆抗体的教学，教师要利用好教材提供的材料，突出从问题入手的思路，先介绍医疗实践中仅靠细胞培养难以获得大量抗体，然后，一步一步启发学生讨论怎样解决这个问题。要把科学家在研制单克隆抗体过程中，通过大胆的想像，创造性地解决问题的过程作为本节教学的重点和亮点，使学生在获得单克隆抗体知识的同时，受到创新精神的教育。【教学课时】二课时 【教学过程】
（一）导入新课 图片展示:克隆羊“多利”的复制品 投影：新华网
克隆羊多利重生 这4只克隆羊在遗传上与多莉毫无差异。多莉诞生于14年前，是第一个使用成熟细胞克隆的哺乳动物。克隆羊多莉(dolly)已经获得“重生”。最初进行此项克隆研究的英国科学家又培育出4只克隆羊，被形象地称之为“dollies”(多莉的复数)。它们是多莉的复制品，在遗传上与多莉丝毫不差，多莉在7年前离开这个世界。
问题导入
师：克隆羊“多利”的重生，采用的是什么技术？ 生：细胞工程技术？
师：动物细胞工程技术到底是干啥的？下面请同学们带着以下问题阅读与总结：（阅读课本p53,回答）
一、动物细胞工程：
1、主要理论依据？ 2技术手段？ 学生：1.细胞生物学 分子生物学
2.①动物细胞和组织培养 ②细胞核移植③体细胞克隆④细胞融合⑤单克隆抗体制备
3.①探索并改造生物的遗传特性，②大量培养细胞。
师：动物细胞与组织培养是细胞工程的基础，它开始于20世纪初期，那么动物细胞与组织培养主要是指什么？请读课本p53-54,完成以下内容。
二、动物细胞与组织培养：
1、概念： ①材料：取自 ； ②场所： 模拟动物体 ；
③条件：在、和 等条件下； ④目的：
使
动
物
细
胞
或
组
织
继续。
学生：①动物胚胎或出生后不久的幼龄动物的器官或组织
②体外 体内环境 ③无菌 温度适宜 营养充足 ④生长、增殖并维持原有结构和功能
师：动物细胞与组织培养是指在体外模拟动物体内环境，将动物体细胞或组织，在无菌、温度适宜和营养充足条件下培养，使其继续生长、增殖并维持原有结构和功能的技术。那么请同学们思考并讨论一下问题：（投影展示）
1、动物细胞培养的原理是什么？
学生：
1、细胞增殖
2、为什么要取动物胚胎或出生后不久的幼龄动物的器官或组织进行培养？
学生：因为这些组织或器官上的细胞生命力旺盛，分裂能力强。一般幼体细胞比老龄细胞易培养，分化程度低的细胞比分化程度高的细胞易培养。
3、动物细胞体外培养需要满足哪些条件？ 学生：①无菌、无毒的环境：（添加一定量的抗生素；定期更换培养液，以便清除代谢产物。）②营养物质(引导学生引导学生引导学生引导学生区分天然培养基与合成培养基区分天然培养基与合成培养基区分天然培养基与合成培养基区分天然培养基与合成培养基)（无机盐、葡萄糖、氨基酸、核酸、维生素、动物血清等。）③温度和ph：37℃, 7.2-7.4 ④气体环境： o2和co2（95%空气和5% co2）
4、组织分散成单个细胞的方法是什么？ 学生：用胰蛋白酶处理。教师补充：动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。
5、能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？ 学生：不能，因为动物细胞培养适宜的ph为7.2—7.4，此环境下胃蛋白酶（2.0）没有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性较高。投影展示：动物细胞与组织培养过程
示
意
图
10代细胞 教师：：：： 悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁生长当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。
思考：细胞发生接触抑制后如何使细胞继续分裂增殖？ 学生：将原代培养的细胞分离稀释后转入新的培养瓶中继续培养，称为传代培养。
思考：传代培养的细胞能一直传代下去吗？
细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到40～50代，这种传代细胞为细胞株。
细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。教师引导学生总结动物细胞培养过程。
过渡：动物细胞培养能否像植物组织培养那样最终培养成新个体？我们来一起比较一下这两个过程：比较项目 植物组织培养 动物细胞培养 因此，目前还不能用类似植物组织培养的方法获得完整的动物个体，用动物体细胞克隆的动物，实际是通过核移植来实现的。
三、细胞核移植与动物体细胞克隆: 读课本p54-57,完成以下内容。
1、体细胞克隆： 是将供体 的细胞核与受体去核 的细胞质进行，借助于 的发育能力，经过培养发育成 进而形成 的技术。其关键是。
学生：细胞核 卵细胞 人工组合 卵细胞 胚胎 个体 细胞核移植技术
2、细胞核移植： 是一种利用 将某种动物细胞的移入
或
动物的去除细胞核的成熟 内的技术。
学生：：：：显微操作技术 细胞核 同种 异种
3、展示克隆羊“多利”产生过程归纳克隆流程： 供体细胞 →
①
-------→ ③------→ 早期胚胎------→ 代孕动物 受
体
细
胞
→
②
-------→ 克隆个体
学生：细胞核 去核的卵细胞 融合的细胞
问题：1）、上述多利羊的成功培育过程表明了什么？也反映出了什么问题？
学生：动物体细胞核具有全能性。许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体型过大，异常肥胖，发育困难，脏器缺陷，免疫失调等。
2）、书上说治疗性克隆和生殖性克隆的大讨论，你有何观点，请说出来。你认为生殖性克隆会带来哪些伦理上的问题？（发散思维）3）克隆个体性状与亲本性状的关系怎样？ 学生：克隆个体性状与供核亲本性状一致。
4、意义：在克服动物、创造 等方面有重要意义。
学生：种间杂交繁殖障碍 新物种
5、应用① ；② ； ③ 等。
学生：①利用克隆技术大量复制实验动物，减少实验误差；②利用异种动物借腹妊娠挽救珍稀动物 ；③利用患者自身的细胞培育新的组织和器官以治疗疾病。
四、细胞融合与单克隆抗体：读课本p57,完成以下内容。
（一）细胞融合：
1、概念：指在一定的条件下将 或 细胞 为 的过程。
2、结果：形成，如。
3、原理：
学生：
1、2个 多个 融合 一个细胞
2、杂种细胞 鼠—鸡、鼠—猴等
3、细胞膜具有一定的流动性
4、物理法、化学法和生物法
5、制备单克隆抗体 动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较：：：： 植物体细胞杂交（获得杂种植株）动物细胞融合（制备单抗）原理 融合前的处理 促融方法 意义和用途 过渡：何为单克隆抗体？
（二）单克隆抗体：：：：读课本p58-59,完成以下内容。
1、概念：用单个b淋巴细胞进行，形成，其就可能产生出化学性质、的抗体——单克隆抗体。学生：无性繁殖细胞群单一性
动物细胞工程试题 动物细胞工程题目及答案篇二
生物化学复习题
第一章: 蛋白质的结构与功能
1．蛋白质元素组成，利用何种元素可推算出其在样品中含量？ 2．组成蛋白质的氨基酸基本分类，根据是什么？
3．蛋白质的一级结构与空间结构（二、三、四级，基元）概念，稳定力量。4．α－螺旋和β－折叠的结构特征。5．多肽链中氨基酸测定，主要分析方法。6．蛋白质分子量测定基本方法有几种？ 7．蛋白质变性及理化性质改变的特征
8．何谓蛋白质的等电点（pi）？在酸性或碱性环境中，某一pi的蛋白质带电荷会一样吗？会带何种电荷？ 9．蛋白质亲水胶体特征及稳定因素。10．蛋白质分离纯化基本依据？常用方法。
第二章: 核酸的结构与功能
1．单核苷酸的组成成分，及其各成分之间的连接方式
atp、nad、andp、fad、camp的组成和中文读法 2．dna分子一级、二级、三级结构概念
（注意原核与真核生物的相似与区别）
3．参与pr生物合成的三种rna（trna、rrna、mrna）细胞含量、分子大小、稳定性、构成或构型。4．核酸的理化性质包含哪几个方面？
5．核酸变性、复性、杂交概念（注意在某一种情况下构型的变化）6．dna、rna分离纯化的基本原则
7．核酸含量的测定方法有几种？方法的建立以何种核酸成分为基础的？
第三章: 酶
1．作为生物催化剂的特点 2．何谓酶的专一性？分几类？
3．酶分类的根据？分几类？命名分类？ 4．全酶构成？各成分在酶促反应中作用？ 5．金属离子在酶分子中作用？
6．b族vit辅酶形式是什么？一般有何作用？ 7．酶的活性中心及必需基团？ 8．酶促反应影响因素有哪些？ 9．最适ph，最适t，km意义。10．酶高效率的机制？
11．何谓酶的抑制作用？抑制剂分类？
12．竞争性抑制剂与非竞争抑制剂对酶的抑制作用方式各是怎样？
对km，vmax影响如何？
13．从对酶作用考虑，有机磷中毒与重金属中毒机理及急救机理？ 14．寡聚酶，同工酶，诱导酶。15．酶的活性单位定义。
第四章: 糖代谢 1．糖的化学本质是什么？糖类在体内有何生理功能？ 2．什么是糖酵解？有何生理意义？
3．何谓有氧氧化？有氧氧化主要分为几个阶段？有何生理意义？ 4．何谓三羧酸循环？有何生理作用？ 5．什么是磷酸戊糖途径？有何生理意义？ 6．什么是糖异生？其生理意义是什么？ 7．试述丙酮酸是如何异生成糖的？ 8．糖原是如何合成和分解的？
9．试比较肝糖原与肌糖原的合成有何异同点？
10．食物中的淀粉是怎样被消化吸收的？又怎样转变成肝糖原？
11．比较糖代谢各途径在细胞内进行的部位、关键酶、产物、atp的生成与消耗情况。
12．下列反应中各需何种辅助因素或辅酶？各起何作用？
（1）丙酮酸→ 乳酸；（2）葡萄糖 → 6一磷酸葡萄糖；（3）糖原（gn）→ 糖原（gn＋l）（4）琥珀酰coa→琥珀酸十 hscoa；（5）丙酮酸十 co2→草酰乙酸；
（6）3-磷酸甘油醛十 pi→ 1，3一二磷酸甘油酸；
（7）1，3-二磷酸甘油酸→ 3-磷酸甘油酸。13．写出糖酵解和糖异生途径的关键酶
14．6一磷酸葡萄糖、1，6—二磷酸果糖、草酰乙酸是如何彻底氧化的？每 1分子分解时，各产生多少atp？ 15．什么是巴斯德效应？
16．什么是乳酸循环？其生理意义是什么？
17．血糖的来源和去路有那些？胰岛素，胰高血糖素，糖皮质激素，肾上腺素如何调节血糖？ 18．什么是糖原累积症？
第五章: 脂类酸代谢
1.饱和脂酸如何氧化供能？
2.计算软脂酸氧化成水和co2时，可使多少adp磷酸化生成atp？ 3.在体内糖如何转变成脂肪？
4.何谓酮体？酮体是如何生成和氧化？酮体代谢有何生理意义？ 5.血浆脂蛋白可分为那几类？各有何生理功用？
6.何谓脂肪动员？何谓载脂蛋白？何谓脂肪酸的β-氧化？ 7.何谓营养必需脂肪酸？ 8.试述vldl和ldl代谢？
9.列举下列通路的限速酶及其调节因素。
（1）脂肪酸合成（2）脂肪动员（3）胆固醇含成 10.说明下列通路的生理意义。
（1）甘油一酯支路（2）柠檬酸一丙酮酸循环（3）脂肪酸β-氧化
11.胆汁酸盐在脂类消化吸收中有何作用？ 12.丝氨酸如何转变成卵磷脂中胆硷？
13.计算硬脂酸（c18）彻底氧化时生成的 a t p量及合成一分子硬脂酸需要的a t p、nadph及乙酰coa的量。14.脂肪酸进入肝脏后有哪几条去路？
15.胆固醇及脂肪酸合成所需原料如何从糖代谢得到供应。16.进食糖类是通过哪些环节而促进脂肪合成的？ 17.比较脂肪酸合成与脂肪酸β-氧化过程的区别。
第六章:生物氧化
1．解释下列名词
（1）生物氧化（2）细胞色素（3）呼吸链（4）氧化磷酸化（5）p／o值（6）解偶联剂
3．请写出nadh氧化及琥珀酸氧化的二条呼吸链并比较在组成上的异同点。4．组织中肌酸有何生理功能？
5．动物注射2，4一二硝基苯酚，会立即出现体温升高，何故？
6．请写出呼吸链抑制剂在呼吸链中的作用？为何说氰化物对机体是剧毒物质？ 7．电子传递链概念及排列组成 8．电子传递链中atp产生的部位
9．线粒体外还原当量转运入线粒体内的两条途径？
第七章: 氨基酸代谢
1．氮平衡及状态及意义？营养必需aa 食物pr的互补作用 2．蛋白质的消化、吸收与腐败 3．体内蛋白质降解途径
4．联合脱氨基作用形式及部位特征 5．α－酮酸的去路 6．氨的来源、转运与去路
7．鸟氨酸循环、部位，过程，调节 8．高血氨症；肝昏迷氨中毒学说
9．γ－氨基丁酸（ｇａｂａ）、牛磺酸、组胺、５－羟色胺、多胺来源于哪些aa？
10．一碳单位及来源、生理功用
11．巨幼红细胞贫血与一碳单位和甲硫氨酸循环关联？ 12．甲硫氨酸循环过程及生理意义 13．何谓活性甲基、活性硫酸？来源？ 14．心肌损伤患者哪种转氨酶和肌酸激酶升高？
15．tyr与那些神经递质生成有关？白化症，黑尿酸症，巴金森氏与其有何关联？
第八章: 核苷酸代谢
1．核酸消化吸收的基本过程及其有关的消化酶。
2．核酸在体内分解代谢的基本反应通路，嘌呤与嘧啶的分解产物是什么？ 3．嘌呤和嘧啶的合成原料是什么？ 4．嘌呤嘧啶合成途径有哪些？特点？ 5．脱氧核糖核酸如何生成？
6．什么是嘌呤和嘧啶核苷酸合成的补救通路？ 7．体内如何调节嘌呤和嘧啶核苷酸的合成？
第九章: 物质代谢调节
1．物质代谢的特点 2．物质代谢的相互联系 3．组织、器官的代谢特点及联系（营养物质互变关系）4．代谢调节 细胞水平：
酶的隔离分布意义，选择几条相关的代谢途径说明 代谢调节是通过对关键酶活性的调节实现
5．酶活性调节方式：
快速调节：
变构调节及化学修饰调节概念、方式、意义
迟缓调节：
通过对酶蛋白分子的合成或降解改变细胞内酶量。
激素水平的代谢调节：
整体调节：
6．饥饿，应急状态三大营养物质的代谢状态如何？
第十章: dna的生物合成
1．遗传信息传递的中心法则，半保留复制 2．简述原核生物dna-pol的种类及其作用？ 3．dna聚合酶的即时校读
4．dna复制的保真性所依赖的三种机制。5．复制的半不连续性，岗崎片断
6．参与原核生物dna复制的各种酶与蛋白质及其作用。
7．何谓突变，突变有哪些类型。（了解影响突变的因素有哪些）8．简述dna损伤的三种主要修复方式。
9．逆转录及逆转录酶的三种活性。
第十一章: rna的生物合成
1．转录，模板链，不对称转录，核心酶（α2ββˊ），断裂基因 2．何谓启动子，原核生物启动子中有哪些特征序列，作用如何？ 3．简述原核生物转录起始过程。4．简述原核生物转录终止的两种形式。5．简述真核生物中mrna和trna的转录后加工 6．试比较复制和转录过程有何相似和不同。
第十二章: 蛋白质的生物合成
1．顺反子 遗传密码* 开放阅读框架* s-d序列 2．遗传密码有哪些特点？（特点中涉及的概念要掌握）3．氨基酰-trna合成酶的功能及作用特点？ 4．在蛋白质合成过程中，各种rna起什么作用？ 5．简述蛋白质生物合成的延长过程。6．多聚核蛋白体
7．翻译后加工包括哪些方面？ 8．分子伴侣
9．以分泌蛋白进入内质网为例，理解蛋白质的靶向输送。
第十三章: 基因表达调控 1．概念：基因表达、管家基因、组成性表达、操纵子、基因重组、sos反应 2．基因表达的规律 3．基因表达的方式
4．基因转录激活调节与哪些基本要素有关？ 5．原核生物转录调节的特点 6．何谓乳糖操纵子？其结构组成？
7．在以下状态时，乳糖操纵子是开启还是关闭的？为什么？如开启，其转录水平如何？为什么？
a．培养基中同时存在高浓度g和乳糖 b．培养基中只存在乳糖
c．培养基中存在低浓度g和高浓度乳糖
8．trp operon，均为转录调节机制，各自的调节机制特点是什么？ 9．真核生物基因组结构特点及表达调控特点。
10．葡萄糖存在时，大肠杆菌不能利用乳糖，当葡萄糖耗尽后，大肠杆菌才利用乳糖。请运用所学乳糖操纵子的有关知识解释其机制。
第十四章: 基因工程与基因重组
1．自然界常见基因转移及重组现象有哪些？掌握其定义？ 2．dna克隆技术基本步骤？ 3．常用的工具酶有几种？ 4．何谓基因载体？有几类？
5．有哪些方法可以使外源dna和载体dna连接。6．常见的重组体的筛选方式分类？举例说明。
7．现有一研究项目，拟从人dna中获得特定的长约1000bp的片段（此片段编码某生长因子），并拟将此生长因子大量生产。请你根据所学知识（可参阅其它有关资料），拟出一个可行的方案来。8．基本概念：同源重组、特异位点的重组、转化作用、转座子、dna克隆、限制性核酸内切酶、粘性末端、钝性末端、配伍末端、基因组dna文库、cdna文库、基因诊断、基因治疗
第十五章: 细胞信息转导
1．细胞信号传导有关的信息物质分类。2．受体？受体分类（膜受体分类及结构特征）3．受体作用特点 4．传导途径：
画一简单示意图，将膜受体介导的信号传导途径小结，归纳。
并注意传导途径中环节的激活的机制（如g蛋白活化，pka激活，ip3与胞内钙升高关系等）。
5．掌握camp－pka，ca2+－依赖性蛋白激酶激活途径。6．受体激酶活性的有关途径
动物细胞工程试题 动物细胞工程题目及答案篇三
第二节 细胞工程简介──动物细胞工程
教学目标 1．知识方面
（1）动物细胞培养（知道）。（2）动物细胞融合（知道）。
（3）单克隆抗体的制备及应用（知道）。2．态度观念方面
（1）初步培养学生勇于探索，不断创新的精神和合作精神。
（2）通过向学生介绍几大动物细胞工程技术的发展动态及一些新的研究成果，使学生明确人们对生命奥秘的揭示愈加广泛和深入，知识不断更新并向前发展。认识到学无止境，形成终生学习的意识。
3．能力方面
（1）在学习动物细胞培养过程中，学生通过阅读、自学、质疑、讨论、训练、总结等环节，逐步提高独立获取知识的能力、逻辑思维能力、分析问题和解决问题的能力。
（2）由植物体细胞杂交技术导出动物细胞融合过程，培养学生的知识迁移能力、思维能力。
（3）让学生尝试设计革克隆抗体的制备过程，指导学生掌握获取知识和探索生物科学的基本方法，使学生了解生物科学认识模式以发展学生的创造性能力。
重点、难点分析
单克隆抗体既是本小节的重点，也是难点内容。
分析：动物细胞工程常用的技术手段有动物细胞培养、动物细胞融合、单克隆抗体、胚胎移植、核移植等。其中前三大技术为本节教材的主体内容，而胚胎移植、核移植技术以小字科普读物的形式出现，意在使学生在有所侧重的前提下对动物细胞工程发展概况有一个较全面的了解。在教材重点介绍的三大动物细胞工程技术中，动物细胞培养是其他技术（如单克隆抗体、胚胎移植、核移植等）的基础，其价值更多的是通过其他技术成果来体现的。而动物细胞融合技术目前较为成熟的最重要的用途便是制备单克隆抗体。由此可见，单抗技术应属较高层次的动物细胞工程技术。对它的学习有助于学生较深刻地领悟动物细胞工程的真谛，并从两位诺贝尔奖获得者对单抗独具匠心的实验设计中，深刻体会科学态度、科学方法，尤其是创造性的思维品质在科学研究、发明创造中的决定性作用。基于以上认识，单克隆抗体应列为本节的重点内容，同时单克隆抗体技术本身环节多、技术复杂，加之学生对此缺乏必要的感性认识，所以也是本课的难点所在。
教学模式
自学——指导。启发、探究。教学手段
1．动物细胞培养的自制挂图。
2．动物细胞融合、单克隆抗体制备过程的教学课件。3．有关克隆羊“多莉”的录像资料。4．实物投影仪。课时安排 二课时。设计思路
1．采用自学、指导模式对动物细胞培养技术进行较深刻、透彻地学习，为学习其他动物细胞工程技术打好基础。2．教师启发学生回忆植物体细胞杂交过程；通过新旧知识对比，引导学生大胆推测动物细胞融合过程，培养学生知识迁移能力，并通过课件演示全过程，加强直观性，培养学生的观察、思维能力。
3．教师给出资料，引出探究点。学生通过讨论、辩论，设计多种制备革克隆抗体的方案。然后通过观察全过程课件，质疑、释疑（多方向），并由学生概括单克隆抗体的制备工程。
4．胚胎移植、核移植为书中小字内容，以学生自学为主，教师予以适当指导、点拨。5．以“多莉”羊的培育过程为主线，将动物细胞工程五种技术的知识有机地串接起来，构成完整的知识体系。
重点提示
1．在教学中，应强化学生的主体意识，开发学生的潜能，使学生的个性在共性发展的同时也能协调发展，使知识不单是讲课的内容，考试的内容，而成为有利于学生综合素质全面提高的载体和素材。教师应善于从教材内容和学生心理状态出发，采用多种方法设计富有启发性的问题，创设探索的情境，激发学生思考和探索的欲望，从而达到在获取知识的同时培养他们的多方面能力的目的。
2．适当增加难度，能在教学过程中引起学生适度的认识冲突。前苏联教育家赞可夫就极力主张“高难度原则”，以求得学生在一定困难水平出现认知冲突，增强学生参与讨论的积极性，促进其发展。
3．在教学过程中，适度拓宽教学内容，扩大学生的知识面，开发学生的思维空间，有利于学生发散性思维的培养。
4．根据学生的认知水平和教学内容的难易程度，合理安排教学容量，控制好课堂教学的密度；该讲的要讲深、讲透，并善于从多角度、多层面来挖掘知识的蕴含，从而把握好教学的力度；同时还要注意课堂节奏的急缓、疏密、错落有致。
教学过程
动物细胞工程试题 动物细胞工程题目及答案篇四
细胞工程：现代生物技术的重要组成部分，是在细胞水平研究、开发、利用各类细胞的一门技术。
灭菌：是彻底杀菌，即用物理或化学等方法，杀死物体上的一切微生物以及它们的芽孢或孢子，使物体成为无菌状态。
消毒：是非彻底杀菌，即用物理或化学等方法，杀死物体上的有害微生物，但不能杀死全部芽孢。
防腐：是抑菌过程，即用化学或物理方法，防止或抑制微生物的生长繁殖。
动物细胞机械分离法：通过适当的物理学处理手段，将动物组织解离成单个细胞的方法。
动物细胞消化分离法：通过酶或螯合剂把已经切成较小体积的组织进一步分散，使之成为小细胞团或单个细胞状态的方法。
单层细胞培养法：将解离得到的细胞，用培养液制成所需浓度后，接种培养的方法。
悬浮细胞培养法：指细胞悬浮在培养液中生长增殖的培养方法。
动物细胞传代培养：将原代培养细胞分离、稀释，并接种到新培养器内，继续扩大培养的过程。
14、细胞系：原代培养物经首次传代成功后的细胞群体，由原代培养物中的各种细胞组成。
15、有限细胞系：细胞系不能继续传代，或传代数有限，大多数二倍体细胞为有限细胞系。
16、连续细胞系：细胞系在体外培养时表现出具有无限传代的潜力，也称为无限细胞系。
17、细胞株：通过选择或克隆化培养，从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的细胞群。
27、动物细胞培养用微载体：指直径在 50 微米到数百微米不等、适合动物细胞贴附和生长的微珠。
1、细胞重组：采用一定方法从活细胞中分离出细胞器及其组分，然后在体外将不同细胞来源的细胞器进行重组，并组装成有生物活性的细胞或细胞器的一门技术。
2、胞质体：除去细胞核后，由膜包裹的无核细胞。
3、核体：是与细胞质分离得到的细胞核，带有少量细胞质，并围有质膜。
4、微细胞：由一条或几条染色体、少量细胞质和完整质膜包裹而成。
8、核移植技术：利用显微操作等方法，将一个细胞的核移植到另一个细胞中，或将两个细胞的细胞核（或细胞质）进行交换。
3、干细胞：来自胚胎、胎儿或成体内，具有无限自我更新和增殖能力以及不同程度分化潜能的一类细胞。
4、胚胎干细胞：由哺乳动物早期胚胎分离克隆出来的未分化细胞，能分化为机体的各种组织细胞，并具有形成嵌合体的能力。
5、诱导性多潜能干细胞：由已分化的体细胞诱导而来，具有类似胚胎干细胞的高度自我更新能力和多向分化潜能的干细胞。（181）
6、全能干细胞：可以发育成一个完整个体的干细胞，一般指哺乳动物的受精卵和 8 个细胞期以前的卵裂球。
7、亚全能干细胞：失去了发育成完整个体的能力，但仍具有形成内、中、外三个胚层来源的所有细胞类型潜能的干细胞。
13、阐述动物细胞工程的应用前景。
（1）生物制品生产
①动物细胞大规模培养技术的建立和发展，大大促进了生物活性物质、药品和疫苗的生产。
②基因重组技术及杂交廇技术的建立和发展，促进了利用动物细胞表达高质量、高价值蛋白。
③单克隆抗体在多种疾病的诊断和治疗中得到广泛应用。
（2）动物克隆
①采用动物胚胎细胞和体细胞核移植技术，成功克隆多种动物。
②动物克隆技术开发了动物繁殖等领域新途径。
③治疗性克隆也得到广泛应用。
（3）干细胞技术
①干细胞体外培养将造福人类。
②细胞治疗和组织工程。
③药物筛选。
④成体干细胞可塑性的发现。
13、简述血清对动物细胞培养的作用。
①丰富的营养物质；②促进细胞生长繁殖；③细胞贴附；④细胞保护；⑤培养基缓冲
30、阐述无血清培养基的主要种类和补充成分。
（1）无血清培养基的主要种类
①一般意义上的无血清培养基
②无动物来源培养基
③无动物蛋白培养基
④化学组分限定培养基
（2）无血清培养基的补充成分。①激素和生长因子
②结合蛋白
③贴壁成分
④微量元素和低分子量营养成分
⑤酶抑制剂
12、简述动物悬浮细胞培养法的一般步骤。
①分散细胞团块；②计数细胞；③加入培养液；④接种细胞；⑤培养细胞
23、简述适合动物细胞培养的生物反应器应具备的条件。
①混合系统设计良好；②反应器内空间利用率高；③能严格保证无菌环境；④能精确控制；
⑤便于观察和采样
28、简述动物细胞微载体培养系统的特点。
①细胞产率高；②易于控制；③易于分离、收获细胞；④反应器改进容易；⑤适合多种贴壁
细胞培养
29、简述动物细胞微载体培养系统的缺点。
①易受剪切损伤；②价格贵；③需要较高的接种细胞量；④老化后易脱落；⑤需要加入血清
45、阐述微载体动物细胞培养的主要步骤。
①微载体的选择。主要根据所用细胞种类和培养目的来进行。
②微载体浸泡。使微载体水化膨胀。
③微载体消毒。常用高压蒸汽灭菌。
④接种。应该使用对数生长期、分散的单细胞。
⑤培养。在培养器内加入培养液、微小球和细胞。
⑥观察。培养液开始呈酸性时，需要换液，观察细胞生长情况。
⑦细胞计数。采用消化法后计数。
⑧传代培养。消化化后进行传代培养。
⑨分离细胞与收获。通常采用酶消化法，分离细胞一般采用离心法.46、阐述大规模动物细胞培养技术的应用和存在的问题。
（1）应用。①主要生产有重要价值的产品，已经成为生物医药高技术产业的重要部分。
②主要产品有疫苗、干扰素、单克隆抗体、基因重组产品等。
（2）存在的问题
①细胞密度和产物浓度低。
②长时间培养时，细胞分泌产物能力易丢失。
③长时间培养时，产物活性易降低。
④培养成本高。
⑤对细胞代谢和生长特性的基础研究比较欠缺。
⑥在线监测技术不完善。
3、简述动物细胞化学诱导融合优势。
①来源方便；②使用简便；③不需要特殊仪器设备；④融合效率高
6、简述动物细胞融合后融合细胞的筛选方法。
①基于酶缺陷型细胞和药物抗性的杂交筛选；
②基于营养缺陷型细胞所建立的杂交筛选；
③由温度敏感突变型细胞所建立的杂交筛选；
④应用荧光激活细胞分选仪进杂交细胞筛选
7、简述单克隆抗体的技术流程。
①亲本选择；②细胞融合；③杂交细胞的筛选；④克隆培养；⑤单克隆抗体生产
8、简述单克隆抗体制备过程中细胞融合的步骤。
①脾细胞和鼠骨髓瘤细胞的混合；②逐滴加入 peg；③终止 peg 作用；④用 hat 悬浮细胞；
⑤分装融合细胞
11、简述影响胞质体制备的因素
①细胞密度；②细胞松弛素剂量；③离心温度；④离心速度；⑤离心时间
15、简述核移植的一般操作程序。
①核受体和核供体的制备；②核移植；③重组胚的活化；④培养；⑤胚胎移植
16、简述核供体细胞对核移植效率的影响因素。
①细胞周期；②细胞类型；③细胞分化程度；④传代次数；⑤供体动物年龄
23、简述动物克隆技术中存在的问题。
①成功率低②克隆动物的遗传问题；③可应用性；④技术不成熟⑤基础理论研究还很薄弱
24、阐述核移植的一般操作程序。
①核受体细胞的制备。大多采用去核的 mⅱ 期卵母细胞为受体。
②核供体细胞的制备。核供体细胞应该是完整的二倍体、基因组，能正常发育。
③细胞核移植。常用胞质内注射和透明带下注射两种方法。
④重组胚的活化。一般重组胚电融合时所施加的电脉冲在诱导融合时，具有激活重组胚的作用。
⑤重组胚的培养。有体内和体外培养两种方式。
⑥重组胚的胚胎移植。胚胎移植后的妊娠率和产仔率是判断移植效率的最终标准。
⑦核移植后代的鉴定。一般从形态、性别上鉴定，还可采用分子生物学技术鉴定。
25、阐述动物克隆技术的意义及存在的问题。
（1）动克隆技术的意义
①促进生物学基础问题的研究 ②加速良种繁育，保护濒危动物 ③培育转基因克隆动物，生产生物药物 ④与基因和干细胞技术结合，开展治疗性克隆
（2）动物克隆技术中存在的问题
①成功率低②克隆动物的遗传问题③可应用性④技术不成熟⑤基础理论研究还很薄弱
18、简述胚胎干细胞的形态学特征。
①细胞体积小；②核大；③核质比例高；④核仁明显；⑤体外培养呈集落状生长
19、简述用于胚胎干细胞鉴定的分子特征。
①碱性磷酸酶（akp）；②转录因子 oct-4；③端粒酶；④阶段性特异性胚胎细胞表面抗原（ssea）
20、简述动物细胞分离纯化的常用技术。
①利用细胞体积；②利用细胞密度；③选择性细胞凝集；④基于不同黏附特性；⑤利用细胞
表面标志
简述诱导多潜能干细胞（ips）的应用前景。
①细胞核重编程机制的研究；②临床医学研究；③新药研发及筛选；④其他物种 ips 细胞的建立
28、阐述干细胞的概念、干细胞的分类和生物学特点。
（1）干细胞是指来自胚胎、胎儿或成体内，具有无限自我更新和增殖能力以及不同程度分
化潜能的一类细胞。
（2）干细胞的分类
①根据来源分为胚胎干细胞、成体干细胞和诱导性多潜能干细胞。
②根据分化潜能分为全能干细胞、亚全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞
（3）干细胞的生物学特点有：
①自我更新能力。指分裂后子代干细胞能保持与自己相同的基因型与表型，维持未分化状
态并具有相同的分化潜能。
②分化能力。指分裂后转变为形态、机能、化学构成上与自己相异的子代细胞。
③增殖能力。指通过细胞有丝分裂实现细胞数量的扩增。
29、阐述胚胎干细胞的应用前景和存在问题。
胚胎干细胞：由哺乳动物早期胚胎分离克隆出来的未分化细胞，能分化为机体的各种组织细
胞，并具有形成嵌合体的能力。
（1）胚胎干细胞的应用前景
①探讨胚胎发育的调控机制。②临床应用。可用于临床细胞、组织和器官的修复和移植治疗，建立动物模型等。③建立药物筛选和研究平台 ④动物克隆及改良
（2）存在的问题
①维持胚胎干细胞未分化状态的机制及定向诱导分化的调控机制尚不清楚。②临床治疗存在安全性问题 ③器官克隆与移植仍有待于技术上的突破。④面临伦理、宗教和社会学问题
30、阐述什么是组织工程及理想种子细胞的标准。
组织工程：是将细胞工程和材料科学相结合，利用具有较好生物相容性的材料，按缺损组织
或器官的结构要求制成模型或支架放在体外培养系统中，使细胞沿着模型或支架不断生长扩
增，构建成新的组织、器官。
理想种子细胞的标准主要包括：
①来源广，数量充足 ②容易培养，黏附力大，增殖力强，可大量扩增 ③遗传背景稳定，具备特定的生物学功能 ④纯度高，具有特定功能的细胞占主导 ⑤免疫排斥反应极小或无免疫排斥反应 ⑥分子结构和功能与再生组织的正常细胞相似⑦临床上易取得，供体损伤小，具有实用性 ⑧植入体内能高质量地修复组织并能保持良好的远期效果
动物细胞工程试题 动物细胞工程题目及答案篇五
1.体外培养的细胞按生长方式可分为哪二种? 按细胞在体外生长的形态特征,可分为哪几种常见类型? ⑴按生长方式分为二型：
粘附型细胞:附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。
悬浮型细胞:不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。（绝大多数有机体细胞属粘附型细胞。）
⑵可分四型：(1)上皮型细胞(2)成纤维型细胞(3)游走型细胞(4)多形型细胞 2.简述体外培养细胞的整个生命活动过程的分期及每代贴附生长细胞的生长过程 ⑴通常，体外培养细胞的全部生命期大致可被分为以下三个阶段：
①原代培养期：也称初代培养，是指从机体中取出细胞接种培养到第一次传代之前的这一阶段。此期的细胞呈现出活跃移动的特点，可见细胞分裂，但不旺盛。处于原代培养阶段的细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上有很大的相似性。细胞群具有明显的异质性，细胞间的相互依存性强，在软琼脂培养基培养时细胞集落形成率很低。②．传代期 ：通常是培养细胞全生命期中持续时间最长的时期，原代培养的细胞经传代后常被称做细胞系。一般情况下，正常体细胞在传代10-50次左右后，细胞分裂的能力就会逐渐减弱，甚至完全丧失，细胞便进入衰退期。
③衰退期：处于衰退期的培养细胞，增殖速率已经变得很慢或不再增殖，直至最后衰退死亡。
以上特点，主要是针对体外培养的机体正常细胞，对于体外发生转化的细胞和肿瘤细胞而言，永生性或恶型性的获得使得这类细胞获得持久性的增殖能力，这样的细胞群体常被称为无限细胞系或连续细胞系。
⑵每代贴附生长细胞的生长过程：①游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态，也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。时间：10分钟一4小时②贴壁期：细胞附着于底物上，游离期结束。底物：玻璃、塑料、胶原、其它细胞等③潜伏期：此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24小时。④对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。⑤停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂 机制：接触抑制、密度限制 3.简述体外培养细胞对生存环境的基本要求.⑴细胞的营养需要：①基本营养物质： 氨基酸（１２种＋谷氨酰胺）、维生素、葡萄糖、核糖、脱氧核糖等无机离子。②促细胞生长因子：多由血清提供
⑵细胞的生存环境：①温度条件对细胞生长的影响：不同生物来源的组织细胞培养温度不同；体外培养动物细胞最常用的温度是37℃，耐低温不耐高温。在生理温度范围内，温度与细胞生长率之间存在正相关关系。②气相环境对细胞生长的影响：动物细胞培养的气相环境都是采用5%co2与95%空气（提供氧）的混合气体。ｏ2参与细胞的能量代谢过程，ｃｏ2用于维持培养液的酸碱度，一般多为开放式培养 ③培养液的酸碱度对细胞生长的影响：大多数的有机体细胞能在ph6.0～8.0的环境中生存。最适宜的ph值范围是7.2～7.4。体外培养的正常细胞耐酸能力要强于耐碱能力④无污染、无毒。
4．什么是细胞培养用液,主要分为哪几类? ⑴培养用液是维护组织细胞生存、生长及进行细胞培养各项操作过程中所需的基本溶液。⑵主要包括：平衡盐溶液 ；
培养基；
其他培养用液。5．d-hank’s与hank’s的主要区别是什么? d-hank’s不含有ca2+、mg2+，常用于配制胰酶溶液。6．简述胰酶的常用浓度及配制时的注意事项。
胰酶(trypsin)溶液： 浓度一般为0.1％～0.25％，配制时要用不含ca2+、mg2+及血清的平衡盐溶液。
7.细胞培养中血清的主要作用？
(1)提供基本营养物质 ；(2)提供贴壁和扩展因子(3)提供激素及各种生长因子；(4)提供结合蛋白(5)对培养中的细胞提供某些保护作用 8.血清的使用与储存有哪些注意事项？
（1）使用前的处理：使用前通常在56℃加热30分钟，这一过程称为灭活。热灭活目的：灭活血清中的补体成分。对于一些品质高的胎牛血清和新生牛血清可以考虑不经灭活直接用于细胞培养。
（2）储存条件：血清一般储存于－20℃,同时应避免反复冻融。大包装的血清，首先将血清灭活处理，然后分装为小包装，如10ml、20ml、50ml，储存于-20℃，使用前融化。融化后的血清在4℃不宜长时间存放，应尽快使用。9.简述干粉培养基的配制过程。
dmem培养液的配制（举例）： ⑴900 ml ddh2o于1000 ml烧杯中，将dmem粉1包倒入其中，盛粉袋用50 ml ddh2o分次冲洗，也倒入容器，磁力（或玻棒）搅拌溶解。⑵用5％－10％的nahco3调ph至7.2。⑶加青、链霉素至终浓度100u/ml 和100ug/ml ⑷用0.22um的滤膜过滤除菌。⑸分装（200 ml左右）后4℃冰箱保存。
10.细胞培养工作室可分为那几个部分，各有什么作用? 一般包括：准备室、培养室和缓冲室。作用：⑴准备室：用于进行培养器皿的清洗、包装、培养物质的准备和消毒以及供应物品的保藏等。⑵培养室：用于进行细胞培养和各种无菌操作的实验室。其基本条件是：清洁、无菌、干燥、不通风，并具有适宜的光线。天花板不宜高过2.5m。⑶缓冲室：（更衣室）2培养箱的作用及使用中的注意事项。
用于维持适当温度、湿度与ph。注意事项：⑴质量关键在控温装置，温度变化一般不应超过0.5度;培养箱的温度设在35～37℃，这是人和哺乳动物培养细胞的最适温度。⑵培养容器需与外界保持通气状态。⑶箱内空气应保持干净，定期消毒（紫外灯、酒精）⑷水槽:保持一定湿度
12.试述清洁液的配方组成及配制时的注意事项。
⑴清洁液 :重铬酸钾（g）浓硫酸（ml）蒸馏水（ml），强清洁液
63∶1000∶200，次强清洗液
120∶ 200∶1000，弱清洁液
100∶ 100∶1000 ⑵配制时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体裸露部分。配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸，并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制溶液应选择塑料制品。配成后清洁液一般为棕红色 13．简述消毒灭菌的常用方法、要求条件及主要应用范围。⑴物理消毒灭菌法
①紫外线：用于空气，操作台表面和不能使用其它法进行消毒的培养器皿。消毒时间：30min（至少）； 紫外杀菌功能除了紫外本身以外，还可以由产生的臭氧来完成。紫外灭菌以后，最好过一个小时再进去。②过滤：0.22μm（适用于液体）③湿热（高压蒸气灭菌法）15磅,121℃，20min 各种物品有效消毒压力和时间不同，一般要求如下：
培养用液、橡胶制品
l0磅l0分钟
布类、玻璃制品、金属器械等
15磅20分钟
④干烤：160℃, 2 小时（适用于玻璃器皿等）注意：消毒后不要立即打开箱门，以防冷空气骤然进入引起玻璃炸裂，影响消毒效果。
⑵化学消毒灭菌法：①7５%酒精
主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理。②1－２‰新洁尔灭
主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒。③抗生素
主要用于培养用液灭菌或预防培养物污染。细胞培养中最常用的抗生素是青霉素（常用浓度是100u/ml）与链霉素（100μg/ml）。不要在原代培养中加入抗生素。
14.如何对玻璃器皿进行有效清洗？
玻璃器皿的清洗：浸泡—刷洗(+烘干)—浸酸—冲洗；清洗后的玻璃器皿：干净透明无油迹。⑴浸泡： ①初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶掉。②新的初次使用的玻璃器皿，在生产及运输过程中，玻璃表面带有大量的干固的灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一些对细胞有害的物质等。先用自来水简单刷洗，然后用5％稀盐酸液浸泡过夜，以中和其中的碱性物质。③再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使用过的残留蛋白质，干固后不易洗掉，用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面上。⑵刷洗：用毛刷（特制的羊毛刷）沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢的杂质。刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度。自然晾干或烘干后泡酸。⑶浸酸：玻璃器皿浸泡到清洁液（洗液）中。清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质。浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面。浸泡时间：一般为过夜，不应少于6 小时。⑷冲洗：在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗,使之尽量不留污染或清洁液的残 迹。最好用洗涤装置。如用手工操作，需流水冲洗十次以上，每次水须灌满及倒干净，然后用蒸馏水清洗3-5 次，晾干（或烘干）备用 15．细胞培养中最常用的抗生素及使用浓度是什么? 青霉素（常用浓度是100u/ml）与链霉素（100μg/ml）。
16．什么是原代培养？简述原代培养方法的分类及主要操作步骤。
⑴原代培养：取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称原代培养。⑵原代培养方法分类：贴块法和消化法。消化法又分为冷消化与热消化；一次性消化与分次消化。主要步骤：
贴块法：将取得洗净并剔去多余成分的组织切成约1mm3大小的植块，用于植块培养。消化法：将取得洗净并剔去多余成分的组织剪碎——蛋白酶溶液消化——机械方吹打组织块—对滤过液离心（<1000r/min, <10min）——用培养液悬浮成细胞悬液——计数并调节细胞密度——用于分离细胞培养
17．何谓传代培养？简述贴壁细胞的传代操作步骤。
⑴传代培养是指细胞从一个培养瓶以1：2或其他比率转移，接种到另一培养瓶的培养。⑵贴壁细胞传代培养： ①选取生长良好的细胞，在超净工作台的酒精灯旁，倒去瓶中的旧培养液，加入2～3ml的d-hanks液，轻轻振荡漂洗细胞，以除去悬浮在细胞表面的碎片。②加入适量0.１％－ 0.25％胰蛋白酶消化液，室温消化，倒置显微镜下观察，待细胞单层收缩突起出现空隙时，倒去酶液。③用hanks液洗涤1次，加入适量培养液，反复吹打细胞，使其成细胞悬液。④以1：2或1：3进行分装，并在培养瓶上做好标记，注明代号、日期，轻轻摇匀，37 ℃co2培养箱培养。⑤观察：细胞培养24h后，即可观察培养液的颜色及细胞的生长情况。18．收集细胞时一般常用的转速和时间是多少？ 转速：1000r/min；时间：5min
19.什么是冷冻保存？影响细胞冷冻保存效果的因素有哪些？
⑴冷冻保存(cryopreservation)：将体外培养物悬浮在加有冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度(一般是低于-70℃的超低温条件)，并在此温度下对其长期保存的过程。⑵①冷冻速率当冷冻速度过慢时，细胞脱水严重，细胞体积严重收缩，超过一定程度时即失去活性。冷冻速度过慢，还会引起细胞外溶液部分结冰，从而使细胞外未结冰的溶液中溶质浓度增高，产生溶质损伤。
当冷冻速度过快时，细胞内水分来不及外渗，会形成较大冰晶,造成细胞膜及细胞器的破坏，产生细胞内冰晶损伤。②冷冻保存温度：液氮温度(-196℃)是目前最佳冷冻保存温度。应用-70℃～-80℃条件冷冻保存细胞，短期内对细胞活性无明显影响，但随着冻存时间延长，细胞存活率明显下降。③复温速率 指在细胞复苏时温度升高的速度。一般来说复温速度越快越好。常规的做法是，在37℃水浴中，于1～2min内完成复温。在冷冻复苏中遵循：慢冻速溶原则。④冷冻保护剂：是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质。
分为：渗透性：
常用甘油、dmso
非渗透性
甘油或二甲基亚砜这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。
保护机制：是在细胞冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤；同时，细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩。甘油和dmso并不能防止细胞内结冰。在使用该类冷冻保护剂时，需要一定的时间进行预冷，让甘油或dmso等充分渗到细胞内，在细胞内外达到平衡以起到充分的保护作用。目前，dmso的应用比甘油更为广泛。
非渗透性冷冻保护剂不能渗透到细胞内，一般是些大分子物质。20．冻存的细胞一般如何复苏？
1)将恒温水浴箱的温度调至37～40℃。2)从液氮中取出冻存小管，立即投入37～40℃温水中快速晃动，直至冻存液完全融解。要在1～2min内完成复温。3)将细胞冻存悬液移入离心管，加入约5m1培养液，轻轻吹匀。4)将细胞悬液经800～1000 r/min离心5min。弃上清液。5)给细胞沉淀物加入完全培养液，轻轻吹吸均匀。将细胞悬液移入培养瓶内，加足培养液进行培养。21．简述培养细胞的非玻璃化冻存过程。
非玻璃化冻存——是利用各种温级的冰箱分阶段降温至-70～-80℃，然后投入液氮进行保存；该种方法冻结的细胞悬液或多或少都有冰晶的形成。
冻存过程：(1)待冻存细胞悬液的准备 ：①按常规方法消化处于对数生长期的细胞培养物,制备成单细胞悬液,计算细胞总数。②将细胞悬液以800～1000r／min离心5min，弃上清液。③向沉淀物中加入冷冻液。轻轻吹吸均匀，使细胞密度达1×106～1×107个/ml。④按每管1～1.5ml的量，分装于冻存小管内。拧紧管盖。⑤在冻存小管上做标记，包括细胞代号及冻存日期。
(2)分级冷冻：①先将冻存小管放人普通冰箱冷藏层(4～8℃)，约40min。②接着置于普通冰箱冷冻层(-10～-20℃)，30～60min。③再于-30℃放置30min左右（可省略）。④然后在-70～-80℃下过夜。⑤最后将冻存小管投入液氮保存。还有一种简单的方法，就是将冻存小管先悬挂在液氮罐口20 min，再直接投入液氮中保存。第三种方法是，用4℃预冷的冷冻保护液悬浮细胞，分装冻存小管后，将冻存小管放在4℃下30min；然后置于壁厚1 cm以上的泡沫塑料小盒内封好，立刻将小盒放置在-70～-80℃冰箱中24h以上至1周；再将冻存小管投入液氮中保存。
(3)记录：做好冻存记录。记录内容包括冻存日期、细胞代号、冻存管数、冻存过程中降温的情况、冻存位置以及冻存经手人。22．dmso使用时应注意哪些事项？
⑴在使用dmso前，不需要对其进行高压灭菌，因其本身有灭菌作用。⑵在常温下，dmso对人体有毒，故在配制冷冻保护剂时最好带手套。
⑶由于许多冷冻保护剂(如dmso))在低温条件下能保护细胞，但在常温下却对细胞有害，故在细胞复温融解后要及时洗除冷冻保护剂。23.细胞培养中常见有哪些微生物污染，有何主要特征？
⑴真菌污染：真菌种类多，形态各异，但污染后均不难发现，大多呈白色或浅黄色小点漂浮于培养液表面，肉眼可见；有的散在生长，镜下观察呈丝状、管状或树枝状菌丝，纵横交错穿行于细胞之间。念珠菌和酵母菌呈卵圆形态，散在于细胞周边和细胞之间生长。⑵细菌污染：污染后大多能改变培养液ph培养液变混浊，毒性大的细菌很快导致细胞崩解死亡。加用抗生素的培养用液一般可预防和排除个别少量细菌的污染。⑶支原体污染：支原体是细胞培养中最常见、不易被察觉和干扰实验结果的一种污染。24．运送细胞的比较简便的方法是哪一种，简述其过程。
⑴一是用液氮或干冰保存运输，效果较好，但需用特制容器如小液氮罐等，又因液氮和干冰蒸发均较快，适于空运，比较麻烦;二是充液法运输，比较简便。
⑵充液法运输操作如下： ①选生长状态良好的细胞，待达80%或90%汇合时，去掉旧培养液换入新培养液，量要达到培养瓶的颈部(过满易污染)，保留少许空间，塞紧瓶塞，空气过多运输中气泡运动易使细胞脱落;②妥善包装和运送；一般在不超过四五天到达目的地的情况下，对细胞活力无严重影响;③到达后，倒出大部分培养液，保留正常量，置37℃培养，次日传代。25.简述细胞污染的概念及种类.⑴细胞污染: 凡混入培养环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物，都视为污染。⑵组织培养污染: 微生物：真菌、细菌、支原体和病毒；化学物质：影响细胞生存的非细胞所需的化学成分；细胞：不同细胞类型的交叉污染。
26.细胞培养中污染主要通过哪些途径，一般如何预防？
⑴空气: 培养设施不宜置于通风场所；定期清理净化工作台的过滤层，防止阻塞；操作中应减少空气流动；带口罩；夏季潮湿季节空气中含菌数量多，每立方米内含菌数不应超过1～5个。⑵清洗消毒：培养器皿和容器洗刷不净残留污物、培养用液灭菌不彻底等，都可引入有害物。⑶操作：实验操作马虎、动作不准确、消毒观念不强，使用的吸管、刀、剪沾染微生物等；或封瓶口时不严，都可发生污染。同时培养两种以上细胞，操作不慎使用同一吸管或培养用液，可能导致细胞交叉污染。⑷血清：血清也是污染细胞的来源，有的市售血清制备水平低、检测不严，常已被支原体和病毒污染。⑸组织：初代培养组织常有污染；有的是在手术中污染，有的本身可能是被污染的组织(如已发生溃烂的肿瘤组织)；手术用碘酒消毒后，擦拭不净可能混入碘污染。
27． 细胞计数的操作要领及计算公式是什么？
⑴具体操作程序如下：①取血细胞计数板和盖玻片，用75%酒精擦净。将盖玻片放于计数板上。②用滴管取混合均匀的细胞悬液，滴入计数室内。要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。滴加细胞悬液后约静置1分钟后则可以进行计数。③统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，分别数出四角的四个大格（每个大格含有16个中格）中的细胞数。对压边线细胞：计上不计下，计左不计右
⑵计算：一般以每毫升含细胞数来表示，大方格的面积为1mm2，室深为0.1mm，则体积为0.1mm3。推算得0.1mm3×104，才为1ml体积。所以计算公式为：细胞悬液的细胞数）/ml ＝（四个大格子细胞数/4)×104 ×稀释倍数；计数中，如果细胞悬液的细胞浓度过高，必须稀释后再计；如果细胞数太少,可离心浓缩后再计。每个细胞悬液至少滴样两次求平均值。
⑶用细胞计数板计数时应注意的事项:①不要漏计，不要重复②细胞悬液应混合均匀③浓度不可过高也不可过低。
28.简述细胞生长曲线绘制过程及其应用。
⑴细胞生长曲线(cell growth curve)是观测细胞在一代生存期内的增生过程的重要指标，可根据细胞生长曲线分析细胞增殖速度，确定细胞传代、细胞冻存或具体实验的最佳时间。它以培养时间为横坐标、细胞密度为纵坐标作坐标图。
⑵制作方法：①培养细胞：首先在2４孔培养板内分别接种相同数量的细胞。计数并记录接种的细胞悬液之密度。②计数细胞密度：从接种时间算起，每隔24h计数３孔内的细胞密度，算出平均值。为提高准确率，对每孔细胞可计数2～3次。如此操作至第七天结束。③绘制曲线：以培养时间为横坐标、细胞密度为纵坐标，将全部结果在坐标纸上绘图，即得所培养细胞的生长曲线。29.简述mtt比色法的原理及操作过程。
⑴原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能将染料mtt(二甲基噻唑二苯基四唑溴盐)转变为不可溶性的紫色结晶，后者被dmso（或酸性异丙醇）溶解后所呈现的色度(用od值表示)反映出活细胞的代谢水平。死亡细胞则无此酶活性。溶液的配制
用pbs液(ph7.2)或者生理盐水将mtt配成5mg／m1的溶液。（用0.2µm滤膜过滤）。保存：于4℃避光保存。可用2周。若暂不用，可冻存。
2.实验过程：（1）、将细胞培养于96孔培养板。（2）、按不同实验要求处理细胞。（3）、每孔加入15-20µlmtt液，继续培养3～4h。（4）吸去培养液，每孔加入200µldmso,在微型振荡器振荡5min,充分溶解混匀。（5）在酶标仪上测定光吸收。测定波长为490nm，以只加培养液的的培养皿为空白对照。
3.结果分析 ：细胞存活率=实验组光吸收值/对照组光吸收值*100％
4.注意事项：(1)高浓度血清可影响光吸收值,常使用含10%血清的培养液,在加入异丙醇溶液或dmso前尽量吸净培养液。(2)吸去培养液时动作要慢,以免吸去形成的结晶。30.简述台盼蓝排除检测法原理
原理：由于死细胞的细胞膜通透性发生改变，某些染料可大量进入却不被排出，因而细胞呈色。而活细胞反之，能排出进入细胞内的染料，因而不易着色。此法的原理即是利用死、活细胞对染料的不同反应而区分开两种细胞。最常用的为“台盼蓝排除检测法”
(2)活体染色与细胞计数：①将1滴细胞悬液(贴壁细胞可经0.25％胰蛋白酶溶液消化后，吹打制成细胞悬液)与2滴台盼蓝液混合后，滴入细胞计数板。②2min后，在显微镜下计数至少200个细胞。未着色的为活细胞，呈蓝色的为死细胞。计算活细胞百分比。
注意事项:台盼蓝染细胞时，时间不宜过长。否则，部分活细胞也会着色，会干扰实验结果。
